寡核苷酸，是当今最具颠覆性的分子生物学核心工具。 从qPCR到反义基因治疗，寡核苷酸已经改变了科学家们通过合成和分子生物学所能实现的目标。随着其受欢迎程度的不断提高，人们正在设计新的合成寡核苷酸的方法，使其更平易近人并释放潜力。

虽然合成方法不断进步，但仍然存在一个重大挑战：纯化寡核苷酸。尽管具体情况依应用而异，通常需要高纯度的寡核苷酸，以确保实验的可重复性以及使研究人员能够更好地了解反应通路。然而，复杂的合成过程会产生大量的杂质，这些杂质必须在应用前去除。

为了提高寡核苷酸产率并将研发收益增大化，仔细优化包括纯化在内的工作流程至关重要。然而，由于可能的纯化方法众多，很难知道从何开始。在此，我们探讨了最常见的寡核苷酸纯化方法，并说明了合适的高效液相色谱 (HPLC) 系统如何克服您当前和未来可能面临的挑战，帮助您获得更准确的结果。

了解寡核苷酸合成和杂质

寡核苷酸合成的最常见方法是固相化学合成，这通常需要脱保护、偶联、氧化和加帽步骤。 在此，寡核苷酸在每个合成循环中延伸一个核酸。每个循环中，可能会因碱基未能完成核苷酸偶联反应而生成失败序列或较短的链（“短链”）。同样，低分子量杂质是切割和脱保护反应的副产品。对于寡核苷酸合成后修饰（如标记或双标记寡核苷酸），具有相同序列长度的未修饰寡核苷酸可能会与其他残留试剂（如游离染料）一起保留在粗混合物中，导致显著的复杂性。

为了避免在后续的寡核苷酸应用中出现干扰，去除杂质至关重要。纯化过程的复杂性和选择取决于所需的纯度：例如，使用简单的程序去除低分子量杂质适用于常规PCR用途。然而，对于qPCR或反义应用，所有截短序列和短片段都必须被去除。

除了纯度之外，下游应用的要求还会影响寡核苷酸可接受的产量和性质。这些要求包括序列的长度以及是否经过修饰。对于qPCR或反义应用，制备型HPLC因其高分辨率的分离能力而成为最常用的技术。

通过制备型高效液相色谱（HPLC）实现高纯度

制备型 HPLC 包含多种类型的液相色谱技术，可用于获得高纯度的寡核苷酸。为了纯化中短长度的寡核苷酸，通常单独或联合使用一系列技术：

在此，我们更详细地探讨每种技术。

阴离子交换色谱 (AEX) HPLC

在AEX HPLC中，使用盐浓度梯度逐渐减少寡核苷酸与色谱柱阳离子相之间的相互作用。较长的、带有更高电荷的寡核苷酸被洗脱并与较短链的杂质分离。AEX HPLC广泛用于获得高纯度的未修饰寡核苷酸。通常，这些未修饰的寡核苷酸的长度可达 50-80 个碱基，具体取决于所需的纯度。

寡核苷酸含有磷酸主链，这影响到如何进行纯化：寡核苷酸的长度决定其所含的带负电荷基团的数量。

离子对反相 (IP-RP) HPLC

IP-RP HPLC 是另一种纯化寡核苷酸的色谱技术，使用离子对试剂，例如乙酸三乙铵 (TEAA)。该方法利用全长核苷酸（通常长达40个碱基）和失败序列之间固有的疏水性差异来实现有效分离。流动相是水/有机溶剂混合物，逐渐增加洗脱强度，在杂质之后洗脱出全长的修饰寡核苷酸。 为了提高整体纯度，可以保留寡核苷酸的疏水性 5'-DMT 基团，称为Trityl-On纯化，在此纯化步骤之后再将其去除。

与 AEX HPLC 相比，IP-RP HPLC 特别适用于分离修饰和未修饰的寡核苷酸。它还提供了固相柱无法实现的更高分离分辨率。此外，IP-RP HPLC的纯化产物可直接与质谱仪兼容，便于后续分析。

尺寸排阻色谱 (SEC)

无论何种应用，脱盐以去除盐和小分子杂质，对于纯化合成的寡核苷酸都至关重要。值得注意的是，残留的盐会干扰后续的分析，例如质谱分析，阻碍准确的表征。此外，PCR 应用需要精确的缓冲条件，残留的盐可能会破坏缓冲条件。

盐或其他低分子量杂质与寡核苷酸之间存在显著的尺寸差异，SEC可以有效地利用该差异进行色谱脱盐。较大的分子直接进入树脂球之间的空隙体积，从而首先被洗脱，而较小的杂质会通过树脂球的内部孔隙，从而延迟洗脱。

在HPLC IP-RP 纯化后，使用SEC去除TEEA特别有效。TEEA对活细胞具有高毒性，并且难以通过其他技术（如沉淀等）去除。 此外，SEC可以轻松实现在冻干前对寡核苷酸进行自动化脱盐。

通过自动化提升制备型HPLC的效率

由于潜在副产物众多，大量的寡核苷酸纯化变得必不可少。然而，纯化不仅可能需要多个步骤，而且通常还需要使用不同的色谱柱和方法，很快演变为一个耗时多、成本高的过程。

一套灵活的自动化纯化系统能够在一次连续运行中完成试剂级寡核苷酸的分离、分析和脱盐。相较于多套HPLC系统的策略，可以简化纯化过程，减少工作空间和维护成本。 升级为自动化纯化过程则减少了所需的手动步骤，从而提高整体通量并减少人为错误的风险。

然而，选择合适的系统配置至关重要。 必须考虑几个标准，包括：

为未来的成功做好准备

在选择自动化寡核苷酸纯化色谱系统时，考虑未来的需求至关重要。为了更大限度地提高系统对后续工作流程的适用性，您应该仔细考虑以下五点：

1.哪些步骤需要自动化

您不需要将所有步骤都自动化，但确定哪些环节自动化对未来工作流程帮助最大非常重要。首先分析您当前的手动流程，找出哪些步骤会从自动化中受益。为了选择最合适的液样处理/进样/馏分收集平台，您需要确定可能需要自动化的样本数量或步骤。根据所需的自动化程度，您可以安装一个或多个进样模块，配备自动HPLC柱和流动相切换功能。

2.配置色谱柱

确保灵活的色谱柱配置是未来成功的关键。在最先进的自动化 HPLC 装置中，所需的色谱柱（IEX、RP 或SEC）和相关的流动相可以自动切换，从而可以在同一平台上完成多种纯化选项，也可以在线对所收集的馏分进行HPLC分析控制。您应该考虑一个允许自动色谱柱再生的系统，这将提高通量并最大限度地提高新系统的投资回报率。

3.梯度曲线的重现性

在自动化过程中，梯度曲线的重现性至关重要，但随着工作流程的变化，这种重现性需要在不同规模范围内保持一致。寻找一款具有能够从分析级到制备级执行准确可重复梯度的输液泵的系统。

4.多波长跟踪

随着实验室优先级和工作流程的变化，您可能需要跟踪不同的波长。仔细考虑系统的 UV-VIS 检测器，寻找具有多波长检测器的系统。这些检测器触发馏分收集，它们能够跟踪多个波长（例如，260、290、330 nm），结合条件收集命令（AND/OR/NOT），提高了在更大的寡核苷酸浓度范围内自动收集的可靠性和质量 ，这对于未来的工作可能尤其重要。

5.附加模块和软件

随着时间的推移，工作流程的变化是不可避免的，为了更有效地适应未来，您应该考虑选择一个支持不同配置并容纳附加模块的系统。 例如，在某些系统中，可以添加 pH电导检测器来控制AEX色谱或脱盐过程中除盐的梯度质量。

最后，虽然合适的硬件对于您未来的工作流程至关重要，但软件也同样重要。选择新系统时，确保该软件能够实现安全且可重复的分离以及实验的可追溯性。

一套制备系统，多种自动可能

对于寡核苷酸纯化而言，涉及大量且多样的手动步骤（包括制备、分析和脱盐），非常耗时、复杂且成本高昂。选择一款多功能的自动化平台可以将寡核苷酸纯化的所有不同阶段整合到一套系统中，从而显著简化寡核苷酸纯化工作。VERITY® 寡核苷酸纯化色谱系统允许您连续处理所有纯化步骤，无论规模大小，更大限度地提高产品产量和效率，从而增强您对结果完整性的信心。